نبذة مختصرة عن IL-1β
إن IL-1β هو سايتوكين التهابي يُفرز بشكل أساسي بواسطة خلايا المناعة الفطرية (الذاتية). ويتمتع هذا السايتوكين بخصائص التهابية عديدة، وقد تبيّن بوضوح دوره في مقاومة العدوى البكتيرية والفيروسية والفطرية. كما يؤدي هذا السايتوكين دوراً كبيراً في نشوء الأمراض ذات الوساطة المناعية الخلوية. ويُعد هذا السايتوكين أحد مؤشرات نشاط الإنفلامازوم (Inflammasome)، إذ يوجد ابتداءً داخل الخلايا على شكل Pro-IL-1β، ثم يُفعَّل ويُفرز بعد انفصال جزء منه بواسطة الإنفلامازوم. لذلك يُستخدم هذا السايتوكين على نطاق واسع كمؤشر التهابي في الدراسات المخبرية لتقييم حالة أحد الأمراض أو التأثيرات الالتهابية أو المضادة للالتهاب لأحد الأدوية. تم تصميم وإنتاج هذا الطقم باستخدام أجسام مضادة وحيدة النسيلة (مونوكلونال) ضد IL-1β الخاص بالفأر، لذلك لا يُستخدم لقياس الحالات المماثلة لدى حيوانات أخرى.
| المحتوى | رقم الكتالوج | 96 اختبار | 48 اختبار |
|---|---|---|---|
| لوحات IL1β | KPG-M IL1β P | 96 حفرة | 48 حفرة |
| المعيار القياسي (Standard) | KPG-M IL1β S | 100 ميكرولتر | 100 ميكرولتر |
| HRP-Avidin | KPG-HA | 3 مل | 2.5 مل |
| HRP | KPG-HAA | 50 ميكرولتر | 50 ميكرولتر |
| الركيزة (Substrate) | KPG-SU | 5.5 مل | 2.5 مل |
| محلول الإيقاف (Stopping) | KPG-ST | 3.5 مل | 3.5 مل |
| محلول الغسيل المركّز 10X | KPG-WB | 40 مل | 20 مل |
| الجسم المضاد الكاشف (Detection Ab) | KPG-M IL1β D | 3 مل | 2.5 مل |
| محلول الإذابة (Elution buffer) | KPG-EBE | 5 مل | 5 مل |
المواد المطلوبة
| ماء مقطَّر معقَّم (مقطَّر مرتين) | ميكروتيوب |
| أنواع الماصات ورؤوسها (سمبلر وسرسمبلر) | جهاز الطرد المركزي الصغير (ميكروفيوج) |
| قارئ الإليزا (بطول موجي 450 نانومتر) | |
طريقة تحضير المعيار القياسي (Standard)
يحتاج المعيار القياسي الموجود في الطقم إلى تحضير قبل الاستخدام. لتحضير معيار بتركيز 300 بيكوغرام/مل (المعيار رقم 4)، امزج 25 ميكرولتر من المعيار القياسي مع 1 مل من محلول Elution buffer. بعد ذلك، ولتحضير التراكيز 100 و33 و11 (المعايير أرقام 3 و2 و1)، جهّز ثلاثة ميكروتيوب ورقّمها، وأضف إلى كل منها 200 ميكرولتر من محلول Elution buffer. ثم أضف 100 ميكرولتر من المعيار رقم 4 (المحضَّر في الخطوة السابقة) إلى ميكروتيوب المعيار رقم 3، وبعد المزج الكامل انقل 100 ميكرولتر من المعيار رقم 3 إلى ميكروتيوب المعيار رقم 2، وبعد المزج الكامل أيضاً انقل 100 ميكرولتر من المعيار رقم 2 إلى ميكروتيوب المعيار رقم 1. وبذلك تُحضَّر المعايير رقم 4 (300 بيكوغرام/مل) ورقم 3 (100 بيكوغرام/مل) ورقم 2 (33 بيكوغرام/مل) ورقم 1 (11 بيكوغرام/مل). يُرجى الانتباه إلى ضرورة إجراء هذه الخطوات داخل الميكروتيوب وخارج حفر لوحة الإليزا، لأن ذلك يؤثر مباشرة على دقة الاختبار وصحته.
| OD -450nm | Pg/ml | المعيار |
|---|---|---|
| 0.3-0.09 | صفر بيكوغرام/مل | A1 بلانك |
| 0.7-0.3 | 11 بيكوغرام/مل | B1 المعيار 1 |
| 1-0.7 | 33 بيكوغرام/مل | C1 المعيار 2 |
| 1.8-1.2 | 100 بيكوغرام/مل | D1 المعيار 3 |
| 2.6-2.1 | 300 بيكوغرام/مل | E1 المعيار 4 |
قيم OD الواردة في الجدول مأخوذة من اختبار مراقبة الجودة الخاص بهذا الطقم.
حساسية الطقم: 2 بيكوغرام/مل.
دقة الطقم: Intra assay < %3-4 ، inter assay < %8-10
تحضير المحاليل
محلول الغسيل (Washing Buffer):
لتحضير محلول الغسيل، خفِّف هذا المحلول بالماء المقطَّر بنسبة 1 إلى 10.
HRP-Avidin:
لتحضير محلول HRP-Avidin، ضع أولاً فيال HRP في جهاز الطرد المركزي الصغير (ميكروفيوج) للدوران.
بعد ذلك، بالنسبة لطقم 96 اختبار امزج 37 ميكرولتر من محلول HRP مع 3 مل، وبالنسبة لطقم
48 اختبار امزج 31 ميكرولتر من محلول HRP مع 2.5 مل من محلول HRP-Avidin.
يُرجى ملاحظة أن المحلول المحضَّر يبقى ثابتاً لمدة أسبوع واحد فقط.
قبل البدء باستخدام الطقم، تأكَّد من أن محلول Substrate عديم اللون.
العيّنة
في حال استخدام المصل (السيروم)، تُستخدم العيّنة مباشرة دون تخفيف.
في حال استخدام الأنسجة، يؤخذ 25 ملغ من النسيج المطلوب من العيّنة الأكثر احتمالاً لاحتواء أعلى مستوى من السايتوكين، ويُجانَس (Homogenize) في 500 ميكرولتر من محلول RIPA buffer، ثم يُجرى تخفيف متسلسل حتى 8 مرات بنسبة النصف (1:2). يجب ألا تتجاوز قيمة OD للتخفيف المناسب حداً أقصى قدره 1.5. يجب تجانس عيّنة النسيج في محلول RIPA buffer المحتوي على مثبِّط للبروتياز (Anti-protease). (محلول RIPA buffer غير متوفر ضمن الطقم، يُرجى التواصل معنا للشراء)
المدة الزمنية: 10 دقائق | سرعة الطرد المركزي: 10000 دورة/الدقيقة
طريقة استخدام الطقم
- أخرج اللوحة (Plate) من العبوة واتركها في مكان جاف حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة. حضّر المعايير القياسية وفق طريقة التحضير الموضحة، وأضف 50 ميكرولتر منها إلى الحفر، وطبِّق جميع الخطوات على البلانك (Blank) باستثناء الخطوة رقم 4.
- أضف 50 ميكرولتر من العيّنة المطلوبة إلى بقية الحفر، واحضنها لمدة 40 دقيقة على جهاز الهزّاز (Shaker) بسرعة 100 دورة/الدقيقة في درجة حرارة الغرفة (يجب استخدام لاصق عريض على اللوحة لمنع التبخّر).
- بعد انتهاء مدة الحضانة، اغسل اللوحات 3 مرات باستخدام محلول الغسيل بمعدل 250 ميكرولتر لكل غسلة (بعد إضافة محلول الغسيل، احضن اللوحات لمدة دقيقة واحدة تقريباً في درجة حرارة الغرفة ثم فرِّغها).
- أضف 25 ميكرولتر من الجسم المضاد الكاشف المقترن (Detection Ab) و25 ميكرولتر من محلول HRP-Avidin (المحضَّر وفق تعليمات الطقم) إلى جميع الحفر (باستثناء البلانك A1)، واحضنها لمدة 30 دقيقة على الهزّاز بسرعة 100 دورة/الدقيقة في درجة حرارة الغرفة. يمكن بدلاً من ذلك مزج الكميات المناسبة من Detection Ab ومحلول HRP-Avidin معاً مسبقاً، ثم إضافة 50 ميكرولتر من الخليط الناتج إلى كل حفرة.
- بعد انتهاء مدة الحضانة، اغسل اللوحات 5 مرات باستخدام محلول الغسيل بمعدل 250 ميكرولتر لكل غسلة (بعد إضافة محلول الغسيل، احضن اللوحات لمدة دقيقة واحدة تقريباً في درجة حرارة الغرفة ثم فرِّغها).
- أضف 50 ميكرولتر من محلول الركيزة (Substrate) إلى جميع الحفر، واحضنها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. علماً بأن مدة 15 دقيقة كافية للحضانة عادةً، لكن يمكن تقليصها إذا كانت شدة اللون المتكوِّن عالية، والعكس صحيح، إذ يمكن تمديدها حتى 20 دقيقة إذا كان اللون خفيفاً.
- أضف 25 ميكرولتر من محلول الإيقاف (Stopping Solution) إلى جميع الحفر، ثم اقرأ قيمة الامتصاص (Absorbance) للعينات باستخدام جهاز قارئ الإليزا عند طول موجي 450 نانومتر.